科学家研发新型RNA修饰鉴定技术，能用于探究稀缺生物样本的功能

“对于表观转录组学来说，本次工作解决了领域内的一个长期性瓶颈，为 RNA 修饰的相关研究尤其是遗传材料稀缺情况时的研究，奠定了坚实的技术基础。”对于自己担任共同通讯的一篇论文，美国密西根大学教授区健辉表示。

近日，他和合作者研发出一种名为 picoMeRIP-seq 的新技术。它的优点在于哪怕使用极少量细胞甚至单个细胞，也能进行全局水平的 m6A 鉴定分析。

在生医领域，该技术可用于稀缺生物样本中 m6A 的功能探究、单细胞水平的 m6A 异质性研究、罕见细胞亚群中的 m6A 分析、以及哺乳动物系统中的 m6A 功能性研究。

此前有研究表明，在一些人类疾病的样品中，m6A 修饰呈现出与正常细胞不同的特征。因此，m6A 可以作为潜在的疾病临床诊断标志物。这意味着本次技术有望用于分析临床病人的样本，从而实现更精准的疾病诊断和分类。

举例来说，假如在一些癌细胞群体中，存在数量非常有限的、且处于休眠状态的癌细胞，那么采取此前技术就很难检测 m6A 在其中的调节作用。

而使用本次技术可以更好地研究这些细胞亚群的特性，从而为癌症的预防和治疗提供更具针对性的方法。

此外，作为一种非侵入式的诊断方法，液体活检已经在临床治疗中得到广泛应用。细胞外的生物标志物，例如数量较低的细胞外游离 RNA，在临床诊断中的作用愈加受到关注 [4]。

而本次技术也有希望分析细胞外游离 RNA 上的 m6A 分布情况，从而为探索其与疾病发生的关系提供技术支持。

鉴于 picoMeRIP-seq 是一种基于抗体的技术，因此只需将 m6A 抗体替换为其他 RNA 修饰的特定抗体，就能被推广到其他 RNA 修饰的鉴定。

日前，相关论文以《单细胞 m6A 在体内的定位 pico Me RIP–seq》（Single-cell m6A mapping in vivo using picoMeRIP–seq）为题发在 Nature Biotechnology[3]。

挪威奥斯陆大学李艳蛟博士和美国密西根大学王运浩博士是共同一作；挪威奥斯陆大学教授阿恩·克伦格兰（Arne Klungland）、美国密西根大学教授区健辉、挪威奥斯陆大学国家医院约翰·阿恩·达尔（John Arne Dahl）博士担任共同通讯作者。

如何将所需细胞数目，降至单个细胞级别？

组学，是一个生物学的下属学科。主要包括基因组学、蛋白组学代谢组学、转录组学、脂类组学、免疫组学、糖组学、RNA 组学、表观基因组学等。

最初，人们专注于基因组学，后来逐渐转向转录组学和表观基因组学，最近人们又开始关注表观转录组学。

表观转录组学，是指使用全局性视野的方法，来鉴定细胞内的所有 RNA 分子或信使 RNA 分子上的特定化学修饰。基于此，可以针对化学修饰的生物学功能开展更深入的研究。

在真核生物的 RNA 分子上，存在 150 多种不同的化学修饰。在信使 RNA 的内部，N6-甲基腺苷（m6A，N6-methyladenosine）是含量最为丰富的一种表观遗传学化学修饰。m6A 影响着与 RNA 相关的生物学过程，比如 RNA 的转录、剪接、运输、稳定、翻译。同时，m6A 还可以调节和控制各种生理过程和病理过程。

2012 年，先后有两支课题组报道了 m6A 的鉴定方法，这是一种全局性的基于抗体免疫沉淀的方法 [1-2]。自此以后，表观转录组学领域经历了快速发展的黄金十年。

过去十多年间，RNA 修饰特别是 m6A 修饰，在基础生物学和临床应用上的重要性陆续得到揭示。

此外，通过影响 RNA 分子与 RNA 结合蛋白的相互作用，RNA 修饰还可以影响 RNA 药物的传递和功效。例如，辉瑞公司就曾在信使 RNA 疫苗中引入特定的 RNA 修饰，以用于增强疫苗功效。

然而，长期以来对于 m6A 在哺乳动物早期胚胎发育中的角色，始终没有得到很好的研究。主要原因在于此前的 m6A 鉴定方法，需要大量的生物材料。

例如，之前最常用的依赖抗体的方法，通常需要数万至数百万个细胞。但是，在一些科研场景中，由于生物材料的不足，导致研究人员面临着样本获取难的问题。

举例来说，在小鼠的早期胚胎发育研究中，从精子和卵子的结合开始，会经过几轮的细胞分裂和细胞分化。

单个早期胚胎的细胞数量通常位于 1-100 个的区间。如果利用传统技术进行全局水平的 m6A 鉴定，则需要从实验小鼠体内获取数千甚至上万个早期胚胎，这在资金和人力上是巨大的消耗。

同时，在临床研究中常常无法从患者身上采集到足量的细胞以用于科学研究。就算能够获取足够的细胞组织，假如目标细胞类型所占的比例较低，那就仍然无法满足 RNA 修饰的鉴定分析的要求。

要想克服这一挑战，必须将 m6A 鉴定分析所需的细胞数目，从数万个降到 100 个以下、甚至降至单个细胞的级别。基于这一背景，课题组研发了 picoMeRIP-seq 技术。

使用 picoMeRIP-seq 技术，单个细胞就能开展鉴定

如前所述，本次研究由来自美国和挪威的两支团队合作完成。担任共同通讯作者的挪威奥斯陆大学教授 Arne Klungland 课题组，长期研究表观遗传学修饰在哺乳动物生殖细胞和早期胚胎发育过程中的功能。

2016 年，该课题组的 John Arne Dahl 博士，在低细胞起始量的表观遗传学方法上获得了新突破。

具体来说，他们当时研发了针对低细胞起始量的组蛋白修饰鉴定方法 μChIP-seq，并将其用于小鼠卵子和小鼠早期胚胎发育的研究中，相关论文发表在 Nature[5]。

针对特定组蛋白修饰的抗体，μChIP-seq 可以对分离修饰组蛋白所在基因组位置的 DNA，进行全局性的鉴定分析。

后来，John Arne Dahl 博士独立成组，并继续与 Klungland 教授联手将 μChIP-seq 技术的经验用于 RNA 修饰的鉴定研究。

其中，Dahl 博士和 Klungland 教授联合培养的博士研究生李艳蛟（现为 Klungland 教授实验室博士后）主要负责实验技术开发部分。

期间，李艳蛟设计了一些实验，并梳理了需要解决的技术瓶颈，其中包括：

如何减少实验样品在实验步骤中的损失；如何有效裂解细胞以便释放 RNA 分子；如何将少量的全长 RNA 分子打断至目标长度；如何选择合适的商业化 m6A 抗体；如何洗涤纯化 RNA 样品；如何构建适用于高通量测序的测序文库。

为解决上述问题，课题组使用内表面光滑、且具有特殊设计管盖的实验管来降低 RNA 的附着，从而减少样品损失。

此外，他们尽量减少样品在不同实验管中的转移次数，在同一个管子中完成多个实验反应，以此来减少样品损失。

裂解细胞是本次实验中的关键一步。期间，他们尝试过几乎所有的细胞裂解方法。最终他们发现，只有 Takara 公司的一种细胞裂解液能将细胞充分地裂解，且不会对后续实验步骤产生负面影响。

对于完整的全长 RNA 来说，它通常会形成高级空间结构，而这会影响 m6A 抗体的结合反应。为此，该团队探索了 RNA 的打断策略。

不久之后，课题组摸索出一种打断策略，它能适用于不同起始量的 RNA。通过这种策略，他们得到了所需要的 RNA 片段。

此前有研究表明，不同商业化抗体的性能各不相同。实验中，该团队尝试过多款商业化抗体，最后发现 Millipore 公司的一款 m6A 抗体的实验效果最佳。

随后，他们又建立了 RNA 洗涤的条件。拿到洁净的 RNA 样品之后，如何构建测序文库——成为摆在面前的新挑战。

期间，他们尝试过各种商业化的测序文库构建方法，但是测序文库的质量和总量始终无法满足要求。

后来，李艳蛟对测序文库的制备方法加以改进，成功解决了上述问题。

接着，担任论文共同一作的王运浩通过分析数据得出如下结论：picoMeRIP-seq 可被用于低 RNA 或细胞起始量的 m6A 准确鉴定。

于是，他们开始将 picoMeRIP-seq 用于小鼠卵子和早期胚胎 [6]。在每个发育阶段里，他们都将 49-110 个卵子或胚胎合并在一起来进行 picoMeRIP-seq 实验。

针对小鼠卵子和着床前胚胎中 m6A 的分布情况，该团队绘制出一个全面图谱，借此发现一些重要的基因转录本或 RNA 分子都带有 m6A 修饰。

但是，在当前的 picoMeRIP-seq 实验中，对于每个生物样品来说，都需要研究人员手动完成数百个实验操作。

这个过程非常费时费力，而且实验结果高度依赖实验人员的经验。为解决这个问题，接下来他们计划将 picoMeRIP-seq 推向自动化和机械化的发展方向。

这样不仅能节约时间、人力和资金成本，还可以实现高通量化，即一次处理多个样品。并且还能保障实验结果的稳定性。此外，他们还计划将研究对象扩展到其他细胞资源相对缺乏的场景之中。

参考资料：

1.Meyer, K.D. et al., Cell, 2012, doi: 10.1016/j.cell.2012.05.003

2.Dominissini, D. et al., Nature, 2012, doi: 10.1038/nature11112

3.Li, Y., Wang, Y., Vera-Rodriguez, M.et al. Single-cell m6A mapping in vivo using picoMeRIP–seq. Nat Biotechnol (2023). http://doi.org/10.1038/s41587-023-01831-7

4.Cabús, L. et al., Biomarker Research, 2022, doi: 10.1186/s40364-022-00409-w

5.Dahl, J.A. et al., Nature, 2016, doi10.1038/nature19360

6.Wang, Y. et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2023, doi: 10.1038/s41594-023-00969-x